Чоловіче непліддя – нові перспективи діагностики

сторінки: 10–21

Гаврилюк А.М. к.б.н., доцент кафедра клінічної імунології та алергології, Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького М. Курпіш, , професор, завідувач відділу відділ імунобіології, репродукції та стовбурових клітин Е. Віланд М. Фрончек А. Вацлавська Інститут генетики людини Польської академії наук, м. Познань, Польща А. Мідро , професор завідувач кафедри > кафедра клінічної генетики, медичний університет, м. Бялисток, Польща

 

Транслокації у патогенезі чоловічого непліддя

Реактивні форми кисню та сперматозоїди

Ідентифікація генів, що відіграють ключову роль у сперматогенезі

Висновки

Термінологічний словник [1, 2]

 

У березні цього року у м. Харкові відбувся симпозіум фахівців із репродуктивної медицини «Допоміжні репродуктивні технології в Україні – 20 років успіху», який зібрав кращих вітчизняних і зарубіжних спеціалістів цієї галузі. Зокрема, доповідь професора Мацея Курпіша, завідувача відділу імунобіології репродукції та стовбурових клітин Інституту генетики людини (м. Познань, Польща) викликала надзвичайно великий інтерес у слухачів. У статті, яку ми пропонуємо вашій увазі, подано матеріал цієї доповіді.

Транслокації у патогенезі чоловічого непліддя

Балансуючі хромосомні транслокації мають місце у 0,2% у популяції народжених дітей. Реципрокні хромосомні транслокації (reciprocal chromosomal translocations, RCT) є найбільш розповсюдженими структурними перебудовами у людини. Частота їх виявлення при амніоцентезі (пренатальна діагностика) становить близько 1:250. Серед неплідних чоловіків з різноманітними порушеннями (наприклад з олігоастенотератозооспермією) та серед пар зі звичними викиднями (у яких був хоч один плід з вадами розвитку) такі транслокації зустрічаються у десять разів частіше. Проте не знайдено кореляції між RCT та якістю сперми, дослідженої методом світлової мікроскопії, всупереч факту, що оліготератозооспермія була описана у багатьох носіїв RCT. Аномалії сперматозоїдів на рівні ультраструктури було виявлено тільки за допомогою електронної мікроскопії у стерильних носіїв RCT [17]. У більшості подружніх пар зі звичними викиднями або вадами розвитку плода, а також неплідних чоловіків з різним ступенем олігоастенотератозооспермії частота RCT була у 19 разів вища [16].

Частота репродуктивних втрат суттєво залежить від продукції високої пропорції гамет із незбалансованим генетичним комплектом, і це може по-різному впливати на рівень виживання різних типів незбалансованих ембріонів чи плодів. Однак невідомо, чи всі носії незбалансованих хромосомних транслокацій є неплідними через втрату здатності до запліднення.

Вплив хромосомних транслокацій на плідність розцінюють як: інтерференція з інактивацією Х-хромосоми; контакт з аутосомою; роль генів, включених у транслокацію, у реалізації фертильної функції [17].

Реципрокні сегменти в хромосомах, що беруть участь у балансуючих реципрокних транслокаціях, під час мейозу розташовуються парами, які формують квадривалентні структури, що можуть сегрегувати у п’ять різних типів: почерговий (в таких випадках утворюються нормальні або балансуючі гамети); суміжний I; суміжний II; 3:1 і 4:0 (всі продукують тільки незбалансовані гамети). У спермальному каріотипі носія RCT, який походить зі специфічних типів мейотичних сегрегацій, формуються так звані сегрегаційні структури. Можна припустити, що формування сегрегаційних структур транслокованих хромосом залежить від: морфології та генетичного вмісту хромосом, задіяних у індивідуальні хромосомні транслокації; локалізації точки розриву на особливій хромосомі; довжини інтерстиціального та транслокованого сегментів і числа та локалізації інверсії [16, 17]. У окремих носіїв RCT пропорція каріотипу сперматозоїдів з різних типів мейотичних сегрегацій визначає склад так званих ділянок сегрегації. Нормальні чи генетично балансуючі гамети продукуються тільки як результат почергового типу, коли RCT-хромосоми сегрегують до одного полюса, а хромосоми з нормальною гомологією – до іншого полюса. А в результаті формування таких типів, як сегрегація 2:2 (суміжний I чи суміжний II тип), 3:1 сегрегація (третинна чи взаємообмінна) та 4:0 сегрегація, утворюються тільки хромосомно незбалансовані гамети [10].

За даними літератури, у 85 подружніх пар з реципрокними транслокаціями частота сегрегатів була на межі від 20 до 80% для почергового типу, від 4 до 63% для суміжного I, від 0 до 40% для суміжного II, від 0 до 40% для 3:1 та від 0 до 4% для 4:0 [17].

Існує точка зору, що сегрегаційні ділянки транслокованих хромосом великою мірою залежать від локалізації пошкоджень на окремих хромосомах або пунктів нестабільності на хромосомах, задіяних в індивідуальні RCT [10].

Гамети носіїв незбалансованих реципрокних транслокацій можуть спричинити невдачі репродукції (спонтанні викидні, народження мертвого плода, ранню смерть новонародженого або вроджені вади у нащадків, які народилися живими) [10]. Преімплантаційна генетична діагностика (preimplantation genetic diagnosis, PGD) відкриває для носіїв RCT альтернативу пренатального обстеження і можливість визначити долю вагітності генетично незбалансованим плодом. Мета встановлення пренатального генетичного діагнозу полягає в ідентифікації RCT-носія і як наслідок – в зменшенні числа спонтанних викиднів, бо оцінка перспективності вагітності є прямо пропорційною до кількості нормальних сперматозоїдів [16]. Подаємо кілька клінічних випадків.

Випадок 1. Одне із завдань даного дослідження полягало у порівнянні пропорції генетично незбалансованих чоловічих гамет (анеуплоїдія) в сперматозоїдах батька і сина, які були носіями родинної балансуючої транслокації t(4;5)(p15.1;p12). Потрійне і/або подвійне флуоресцентне забарвлення в гібридизації in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) застосовувалось для дослідження мейотичних сегрегативних ділянок та частоти анеуплодії хромосом X та Y в обох носіїв. Для порівняння паралельно оцінювалася частота анеуплодії в групі неплідних та плідних чоловіків. Додатково було зроблено спробу спрогнозувати схильність до генетичної незбалансованості у нащадків, які народилися, що може бути використано у сімейному генетичному консультуванні. Оцінка ризику несприятливого закінчення вагітності в залежності від мейотичних ділянок сегрегації у носія від транслокації може бути використана як ілюстрація природної селекції генетично незбалансованих плодів і виявитися безцінною для генетичного консультування сімей із подібними RCT [17].

Аналіз еякуляту двох носіїв транслокації t(4;5)(p15.1;p12) показав нормальні параметри еякуляту у батька. Однак у сина тільки 9% сперматозоїдів мали задовільну морфологію, що можна визначити як тератозооспермію. Мейотичні сегреговані ділянки для двох носіїв t(4;5)(p15.1;p12) були визначені методом FISH з потрійним забарвленням у 4-й хромосомі і становили der(4),5 der(5). Для носія 1 (син) частота почергового, суміжного I, суміжного II, 3:1 третинного та 3:1 взаємообмінного (зміна послідовностей) типів сегрегацій становила 34,4%; 24,6; 15,5; 10,6 та 9,5% відповідно. Для носія 2 (батько) відповідні послідовності були 34,8%; 23,1; 17,1; 11,1 і 8,6%. Цікаво, що частота окремих деталей каріотипу сперматозоїдів у батька і сина були схожими. Всі можливі комбінації після 2:2 та 3:1 сегрегацій було розглянуто, і більшість спільних типів сегрегацій відповідали почерговому типу. Зафарбовані ділянки нормального та балансуючого каріотипу після почергової сегрегації були ідентифіковані, але ми не можемо зробити жодних висновків після цього аналізу. Ми знайшли невідомі сигнали в 5,4 і 5,3% сперматозоїдів сина та батька відповідно. Решта неідентифікованих сигналів могли бути результатом обмежених можливостей методу чи рекомбінацій. Ми не могли виявити рекомбінації, що стосуються почергового, суміжного I та 3:1 типів сегрегацій. Було можливим ідентифікувати лише рекомбінації в інтерстиціальних сегментах суміжного II типу сегрегацій. Проте репродуктивний успіх цих носіїв не можна передбачити тільки на основі вищеперелічених відмінностей в параметрах еякуляту. Потрібно також брати до уваги субфертильний статус дружин цих носіїв. Також репродуктивні втрати можуть бути результатом додаткових генетичних причин чи факторів зовнішнього середовища, які модифікували сперматогенез у чоловіків з ідентичними транслокаціями. У випадку носіїв t(4;5)(p15.1;p12) ми переконалися, що внутрішньосімейні варіації впливають на сперматогенез – тільки у сина проявилася тератозооспермія [17].

Випадок 2. Було проведено каріотипування 26-річної жінки (III;6), оскільки у неї в анамнезі зафіксовано один випадок мертвонародження (IV;6) та два викидні на ранніх строках вагітності (IV;7;8). Було виявлено RCT t(7;13)(q34;q13). Після ідентифікації цієї транслокації у неї мали місце три вагітності, в результаті яких народилися дві дівчинки з вадами розвитку (IV;9) і такий же хлопчик (IV;11) – діти померли в перший день свого життя. Також у жінки стався один викидень (IV;10). Хромосомний аналіз померлої дівчинки виявив продовжене довге плече хромосоми 7 та незбалансований каріотип, який інтерпретували як 7q34qter та трисомію 13q13qter. Було зібрано сімейний анамнез у більш далеких родичів, у яких народжувалися діти з вадами розвитку чи мали місце викидні. У сім’ї далеких родичів (III;15) перший хлопчик (IV;18) також народився недоношеним з численними вадами розвитку і помер після народження. Це саме сталося і з дівчинкою (IV;19). Дослідженням каріотипу у родички при перинатальній діагностиці в ІІ триместрі виявлено незбалансовану транслокацію 46,XX, der(7)t(7;13)pat, яка виникла з родинної реципрокної транслокації t(7;13)(q34;q13).

Родовід було складено та узагальнено на основі тривалих спостережень. Було ідентифіковано 45 родичів із 16 різними випадками переривання вагітності. Плоди-носії балансуючих RCT були знайдені в результаті цитогенетичних досліджень у пробанда (III;6) та її братів і сестер (III;8,15), її матері (II;3) та сестер і братів матері (II;2,5,8). Увагу привернули три вагітності, які закінчилися двома спонтанними викиднями (IV;7,8), мертвонароджений 6-місячний плід з вадами розвитку (IV;6), один викидень (IV;10), один мертвонароджений плід (IV;11), одна дитина, яка народилася і відразу померла (IV;9). Рання смерть новонароджених була виявлена і у більш далеких родичів (II;1), (III;3,12,19,25), викидні (III;13,14). Каріотипи від рано померлих братів та сестер пробанда неможливо було проаналізувати. У двох рано померлих нащадків (IV;9,19) було виявлено незбалансовані транслокації у формі моносомії 7q34 qter одночасно з трисомією 13q13 qter [10].

Пропорцію неуспішних вагітностей можна розрахувати на основі прямого аналізу родоводу, розробленого Stene та Stengel-Rutkowski (1988). Всі типи патологічних вагітностей, які встановлено, вираховуються і порівнюються із загальним числом вагітностей. Бралися до уваги три типи наслідків патологічної вагітності: генетично незбалансовані народжені діти; некаріотиповані мертвонароджені або ті, які померли швидко після народження; викидні. Корекція здійснюється за допомогою елімінаційного індексу випадків. Можливі співвідношення генетично незбалансованих народжених живими нащадків не можуть бути встановлені прямо по родоводу (тому що жоден генетично незбалансований нащадок не розглядається як сумісний з виживанням у даному родоводі), але підраховуються непрямо із зібраних емпіричних даних. Імовірність рівня неуспішних вагітностей можна вирахувати за формулою:

formula.jpg

де p – рівень ризику, а – число неуспішних вагітностей після встановлення наявності хромосомної патології, n – число всіх вагітностей після встановлення такої, S – стандартне відхилення [10].

Сперматозоїди здорового 36-річного чоловіка з цієї родини (III;15) з нормальним фенотипом та конституційним каріотипом 46,XY, t(7,13)(q34;q13) були обстежені згідно зі стандартами ВООЗ, при цьому показники знаходилися в межах норми. Вони були проаналізовані для виявлення сегрегаційних ділянок (присутність чи відсутність FISH-сигналів, відповідних до хромосом 7, 13, der [7] та der [13]). У результаті отримано різні типи сегрегаційних ділянок t(7,13)(q34;q13). Було знайдено всі можливі 2:2 сегрегації. У 34% проаналізованих сперматозоїдів було виявлено почергову сегрегацію, і це був найпоширеніший сегрегаційний тип. Оскільки трикольоровий (жовтий, червоний та зелений) FISH-метод не завжди можна використати для визначення нормальних та балансуючих сперматозоїдів, ми не завжди можемо передбачити співвідношення цих двох типів. Сегреганти типу суміжного I зустрічалися з частотою 23,5%, сегреганти типу суміжного II (без рекомбінацій в інтерстиціальних сегментах) рідше були спільними (7,2%) і мали нерівне співвідношення між обома типами незбалансованих сегрегантів. Крім того, 1,5% сперматозоїдів виникли в результаті рекомбінацій всередині інтерстиціальних сегментів або (альтернативно) від нероз’єднаних хромосом в анафазі II (FISH-сигнали були ідентичними в обох ситуаціях). Понад 29,4% сперматозоїдів були утворені за допомогою 3:1 сегрегації (13,4% третинний і 16% взаємозамінний типи сегрегації). Усі можливі фенотипи в нерівних співвідношеннях були представлені між 22 та 24 хромосомами сперматозоїдів. Частота виявлення сперматозоїдів з 22 (19,2%) хромосомами була вищою, ніж частота сперматозоїдів із 24 (10,2%) хромосомами. Відсоток сперматозоїдів з 24, -7, + der 7, +der 13 (4,9%) був вищим у сперматозоїдах з 24 хромосомами. У 2% сперматозоїдів були відсутні сигнали [10].

Ми подали аналіз сегрегаційних ділянок реципрокної транслокації t(7,13)(q34;q13) у чотирьох поколіннях великої родини з вісьмома носіями цієї транслокації (двоє по батьківській лінії, п’ятеро по материнській лінії та один невідомої статі з високою частотою неуспішних вагітностей і з двома генетично незбалансованими мертвонародженим та померлим після народження). Дослідження носіїв мейотичних сегрегаційних ділянок t(7,13)(q34;q13) показало, що каріотиповані незбалансовані гамети дають майже всі теоретичні форми незбалансованості. У випадку RCT генетичне консультування може попередити і вирахувати всі типи патології (генетично незбалансованого нащадка, який народився, або при перинатальній діагностиці; некаріотиповані викидні; мертвонародження чи ранню смерть дитини). Це можна зробити на основі аналізу сегрегацій у родоводі. Ризик для жінок-носіїв такої RCT становить нижче 0,2%. Ризик мати дитину із синдромом Патау є також низьким для жінок і сягає 0,1%.

У результаті ми встановили рівень ризику близько 0,3% для жінок з двома типами незбалансованих сегрегацій і відсутність ризику для чоловіків-носіїв. Однак такий розрахунок ризику має швидше спекулятивне, ніж конкретне визначення, тому що проконтролювати це припущення можна тільки проаналізувавши понад тисячу осіб з родоводу, що практично неможливо. Оскільки рівень народження життєздатних генетично незбалансованих дітей переважно є низьким, спеціалісти пропонують провести PGD та обговорити з батьками її результати для запобігання викидню. Однак незалежно від рівня ризику народження дитини з вадами, рішення батьків дати потомство, преімплантаційна хромосомна діагностика, пренатальна діагностика або готовність прийняти дитину з можливими вадами можуть бути в кожному випадку індивідуальними [10]. Ми встановили, що вирахування мейотичних сегрегацій сперматозоїдів не завжди співпадає зі спостереженнями, які виникають з аналізу родоводу або теоретичного вирахування ризику згідно з формулою Stengel-Rutkowski. Із цього випливає необхідність виявлення та аналізу мейотичних сегрегацій у сперматозоїдах для правильної оцінки і прогнозу неуспіху репродукції.

Випадок 3. Ми зібрали емпіричні дані родоводу з високим (42%) ризиком викиднів із загальної кількості вагітностей (31) у чотирьох носіїв родинної транслокації t(2;7) (p11.2;q22.1) і опрацювали результати досліджень мейотичних сегрегаційних скупчень в сперматозоїдах одного носія [16].

Було виконано PGD бластомерів від одиничного циклу інтрацитоплазматичного введення сперматозоїда (intracytoplasmic sperm injection, ICSI) зі сперматозоїдом цього носія. Ми порівняли відсоток незбалансованих транслокацій, виявлених у сперматозоїдах, із наявністю такої ж генетичної патології в ембріонах, що дало результат після першого циклу ICSI та PGD. Через 9 міс народилася здорова хромосомно нормальна дівчинка [16]. Родовід сім’ї – 43-річний мужчина є носієм балансуючої транслокації t(2;7)(p11.2;q22.1) (II;10), його 29-річна дружина (II;11) мала два викидні – обидва на 2-му і 3-му місяцях вагітності (каріотипування матеріалу не проводилося). Цей пробанд успадкував хромосомну транслокацію по батьківській лінії. Його батько, 86-річний чоловік, дав потомство – п’ятеро фенотипово нормальних дітей (II;2), (II;4), (II;6), (II;8), (II;10), але в його родині було і п’ять викиднів (II;1). Старша сестра пробанда (II;2) успадкувала від батька сімейну реципрокну транслокацію. У неї було два викидні, один на 8-му тижні і один на 4-му місяці. Один старший брат (II;4) випадково загинув, але у його дружини (II;5) не було викиднів. Другий старший брат (II;6) був також носієм батьківської транслокації. Його дружина (II;7) мала два викидні, один на 5-му місяці та один на 7-му тижні вагітності. Інші члени родоводу були недоступні для генетичних обстежень, однак у дружини старшого брата (II;8) мали місце два викидні, обидва на строках 7-8 тиж (рисунок).

ris(2).jpg
Рисунок. Родовід носія транслокації t(2;7)(p11.2;q22.1) (за Wiland E. et al., 2008)

Представникам цієї родини робили класичне каріотипування G-методом диференційованого забарвлення хромосом (GTG-техніка) лімфоцитів периферичної крові. Місце розриву визначали перед виконанням ICSI, робили обстеження сперматозоїдів пробанда методом FISH з триколірною флуоресценцією. Двадцятидев'ятирічній дружині (II;11) пробанда (II;10) провели перший ICSI-цикл, оскільки у родині її чоловіка спостерігався високий ступінь викиднів. Стимуляцію яєчників проводили рекомбінантним фолікулостимулюючим гормоном та людським менопаузальним гонадотропіном. Дванадцять ооцитів аспірували через пункцію яєчника, при чому десять із них знаходились на стадії метафази II. Дев’ять ооцитів були запліднені та культивувалися 72 год. Методом біопсії було відібрано одну бластомеру від ембріона на стадії восьми клітин. Далі проводили FISH восьми бластомерів з двома послідовними гібридизаціями, одна на кожний ембріон. Перша гібридизація стосувалася задіяних в транслокацію хромосом 2 і 7. У результаті проведених досліджень не було знайдено різниці між нормальною та балансуючою транслокацією. Оскільки нас цікавила ідентифікація хромосоми 21 та хромосом X та Y, у пацієнтів було проведено наступну гібридизацію з відповідними реактивами щодо цих хромосом [16] (табл. 1).

ембріона

Ембріон

FISH-сигнали бластомери

Каріотип ембріона

Каріотип сперматозоїда

1

emb1.jpg

 

2p.2p.7p.7р.7q.7q.21.21.X.Y

46.XY or

46.XY.t(2;7)(p11.2;q22.1)pat

23.Y or 23.Y.-2.-7. +der2.+der7

2

emb2.jpg

 

2p.7р.7р.7q.7q.7q.X.X

46.XX.der(2)t(2;7)(p11.2; q22.1) pat

monosomy 2p11.2 pter, trisomy 7q22.1 qter

23.X.-2.+der2

3

emb3.jpg

 

2p.2p.7p.7p.7q.7q.21.21.X.X

2p signals too close

46.XX or

46.XХ.t(2;7)(p11.2;q22.1)pat

23.X or 23.X.-2.-7. +der2.+der7

4

emb4.jpg

 

2p.7p.7p.7q.7q.7q.X.Y

46.XY.der(2)t(2;7)(p11.2; q22.1) pat

monosomy 2p11.2 pter. trisomy 7q22.1 qter

23.Y.-2.+der2

5

emb5.jpg

 

2p.2p.2p.7p.7p.7q.X.Y

46.XY.der(7)t(2;7)(p11.2q;q22.1) pat

tirisomy 2p11.2 pter.

monosomy 7q22.1 qter

23.Y.-7.+der7

6

emb6.jpg

 

Дегенеративне ядро

Немає результату

?

7

emb7.jpg

 

2p.2p.7p.7p.7q.7q.21.21.X.Y

46.XY or

46.XY.t(2;7)(p11.2;q22.1)pat

23.Y or 23.Y.-2.-7. +der2.+der7

8

emb8.jpg

 

2p.7p.7q.X

Гаплоїд?

?

9

emb9.jpg

 

Не виконано PGD

Невідомий

Невідомий

Дослідження сперматозоїдів показало, що 34% з них містили почергові сегрегації, і це був найбільш поширений тип (табл. 2). Сегреганти суміжного I типу зустрічалися з частотою 33% випадків. Точні повтори сегрегантів почергового та суміжного I типів повинні відбутися в результаті кросинговера в інтерстиціальних сегментах. Один кросинговер – первинний по відношенню до почергової сегрегації – дає такі сигнали, як і суміжний I тип. У цьому дослідженні ми припускаємо, що ці перетворення загалом компенсуються. Сегреганти суміжного II типу становили 15%. Тільки 12,7% сперматозоїдів продукували сегрегації типу 3:1, і було знайдено всі можливі фенотипи (5,7% третинних та 7% взаємозамінних сегрегацій). Дослідження методом FISH проводили на восьми бластомерах, хоча запліднених було дев’ять (один ембріон був неінформативний, тому що мав дегенеративне ядро). Завдяки проведеній першій гібридизації та регібридизації було з’ясовано, що три ембріони були нормальні та генетично збалансовані, і їх було трансферовано жінці. Два ембріони імплантувалися. Ультрасонографічно була встановлена потрійна вагітність з близнюками та одинаком. Оскільки проведення PGD не знизило ризик генетично незбалансованої вагітності до нуля, була рекомендована і проведена пренатальна діагностика на строках вагітності 13 тиж. Близнюки були чоловічої статі, носіями батьківської транслокації t(2;7)(p11.2;q22.1); дівчинка народилася з нормальним каріотипом. Після консиліуму (оскільки у жінки виявилася шийкова недостатність та високий рівень ризику викидня) пацієнтці провели редукцію близнюків, гестацію продовжили для однієї дитини. На строках вагітності 38 тиж народилася здорова дівчинка; сьогодні їй вже виповнився один рік [16].

Генотип

Тип сегрегації

Сперматозоїди, %

Бластомери, %

Нормальний/збалансований

 

34,2

37,5

Незбалансований 2:2

Суміжний I

Суміжний I

16,2

17,0

33,2

25,0

12,5

37,5

Незбалансований 3:1

 

12,7 Гаплоїд?

0

12,5

Необстежений/немає результату

 

5,0

12,5

Із вищенаведеного робимо висновок, що дослідженням збалансованості або незбалансованості генетичного матеріалу ранніх зародків підтверджено дані, які вже були отримані з аналізу мейотичних сегрегацій в сперматозоїдах. Це значить, що дослідження мейотичних сегрегацій в сперматозоїдах – достовірний метод оцінки ризику репродуктивних невдач. Це важливо ще й тому, що далеко не кожній парі можна провести преімплантаційну діагностику їх ембріонів, бо вона є технічно складною і виконується в обмеженій кількості лабораторій світу.

Реактивні форми кисню та сперматозоїди В начало статьи

Структура мембрани сперматозоїда забезпечує його гнучкість та функціональну активність. Однак ліпіди сперматозоїдів є субстратами для пероксидації, що може провокувати їхні різні функціональні порушення. З іншого боку, низький (фізіологічний) рівень перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) відображає вплив реактивних форм кисню (reactive oxygen species, ROS) на сперматозоїди, що підвищує їхню здатність до взаємодії з прозорою зоною яйцеклітини. Високий (патологічний) рівень ПОЛ мембрани сперматозоїдів свідчить про розвиток оксидативного стресу і може перешкодити акросомальній реакції. Вільні кисневі радикали можуть бути етіологічними факторами патогенезу багатьох хвороб (табл. 3).

Вільний радикал

Структура

Оксид азоту

NO

Діоксид азоту

NO2

Гіпохлорна кислота

CIOH

Гіпобромна кислота

BrOH

Гіпойодна кислота

JOH

Алкоксильний радикал

C

||

R – C – O

Пероксидний радикал

ROO

Пероксид

ROOH

Супероксиданіон

O2-

Перекис водню

H2O2

Гідроксильний радикал

OH

Характерна риса більшості (але не всіх) біологічних мембран – несиметричне розташування ліпідів всередині біліпідного шару. Ліпідна композиція плазматичної мембрани сперматозоїдів відрізняється від інших соматичних клітин. Вони містять дуже високу концентрацію фосфоліпідів, стеролів, насичених і поліненасичених жирних кислот, тому сперматозоїди особливо вразливі до пошкоджень, індукованих надмірним виділенням ROS [12].

Під час проходження через епідидиміс ліпідні складові сперматозоїдів підлягають змінам. Таким чином, етерифіковані ліпіди отримують великий фосфоліпідний компонент у хвості епідидиміса та дворазове підвищення молекулярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди при міграції сперматозоїдів зі семінофорних труб [12].

У плазматичній мембрані сперматозоїдів виявлено велику кількість поліненасичених жирних кислот, зокрема докозагексаєнової (docosahexaenoic acid), яка регулює стан мембрани та відіграє велику роль у сперматогенезі. Інший ліпід мембрани сперматозоїда, фосфатидилсерин, може переміщуватися при капацитації в напрямку або акросомальної, або екваторіальної ділянки. Сперматозоїди також містять десмостерол, який втрачається під час капацитації. Інший фосфоліпід, сфінгомієлін, знижує рівень стеролів і таким чином впливає на якість капацитації; екзогенна сфінгомієліназа посилює капацитацію, підтримуючи втрату стеролів та продукцію церамідів [12].

Холестерол виступає як регулятор пластичності та проникності клітинної мембрани. Його витік протягом капацитації полегшує масивне надходження екстрацелюлярного кальцію. Підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію має велике значення для акросомальної реакції. Він посилює активацію протеїнкінази, що сприяє активації фосфоліпази А2 та генерації арахідонової кислоти з мембранних фосфоліпідів. Арахідонова кислота під дією ферментів циклооксигенази та ліпоксигенази перетворюється відповідно у простагландини та лейкотрієни. Підвищення рівня Са та рН приводить до проходження через мембрану сперматозоїда акросомального вмісту, тобто акросомального екзоцитозу. Якщо це не потрібно, мембрана в ділянці акросоми є захищеною високою концентрацією антифузіогенних стеролів. До ліпідів, які підтримують проникнення сперматозоїда в яйцеклітину, належать також сульфогалактозилсероліпід та лізофосфатидилхолін. Узагальнюючи, можемо сказати, що всі ліпідні компоненти, локалізовані в мембрані сперматозоїда, задіяні в регуляцію дозрівання сперматозоїдів, сперматогенез, капацитацію, акросмальну реакцію та, очевидно, і у проникнення через мембрану яйцеклітини. Ймовірно, посилення ПОЛ у мембрані сперматозоїдів може порушити більшість цих функцій, а в екстремальних випадках повністю пригнітити сперматогенез [12].

Еякулят кожного чоловіка містить такі потенційні чинники посилення виділення ROS, як активовані лейкоцити, прекурсори зародкових клітин чи морфологічно змінені сперматозоїди. З іншого боку, еякулят кожного чоловіка має інтра- та екстраклітинні антиоксиданти ферментативної чи неферментативної природи. Ферментативні та низькомолекулярні антиоксиданти продукуються в еякуляті для знешкодження вільних радикалів (самозахисні механізми). Найбільш важливими антиоксидантами в еякуляті чоловіка є ферментні антиоксиданти – супероксиддисмутаза, каталаза, глутатіонпероксидаза. До низькомолекулярних антиоксидантів належать α-токоферол; β-каротин; аскорбінова кислота; урати; іони металів, які забезпечують транспорт через мембрану; трансферин; лактоферин; церулоплазмін. При патологічних станах (наприклад запальних процесах урогенітального тракту), зовнішнє утворення ROS призводить до оксидативного стресу сперматозоїдів, який може виснажити антиоксидантну активність. Фінальним ефектом пероксидації є вивільнення ліпідів з мембран сперматозоїдів. Пероксидація поліненасичених жирних кислот в плазматичній мембрані сперматозоїдів є автокаталітичною, самопоширюваною реакцією, внаслідок якої виникає ризик клітинної дисфункції. Це асоціюється з втратою інтегративності мембрани та її функцій. Перший крок у процесі пероксидації називається ініціацією і полягає у відщепленні атому водню від ненасиченої жирної кислоти. Другий крок – поширення – характеризується виникненням ліпідного алкідного радикалу, що утворюється внаслідок швидкої реакції з киснем у формі ліпідного перекисного радикалу. Останній здатний віднімати атом водню від ненасиченої жирної кислоти з наступним формуванням ліпідного радикалу та ліпідної гідропероксидази. Оскільки пероксидний та алкідний радикали є регенерованими, цикл поширення може продовжуватися або на невизначений час, або тільки у виняткових випадках швидко на одному субстраті. Це потрібно розрізняти. Називається цей процес реакцією радикал-радикал. Продукти ПОЛ, а саме поліненасичених жирних кислот, можуть бути причинними факторами розвитку різних патологічних станів, в т.ч. непліддя, серцевих та мозкових ішемічних/реперфузійних пошкоджень, запальних захворювань суглобів. Перекисне окислення в біологічних мембранах спричиняє порушення структури та функцій мембрани, зменшує її пластичність, інактивує мембранозв’язані рецептори і ферменти та підвищує неспецифічну проникність для іонів. Існує припущення, що ПОЛ декомпенсується в присутності іонів заліза або інших факторів, що містять метал, таких як гем, гемоглобін та міоглобін. Цитотоксичні альдегіди формуються внаслідок гідропероксидної деградації ліпідів. Малоновий диальдегід та 4-гідроксиноненал є гідрофільними і виділяються ліпопротеїнами низької щільності (low density lipoprotein, LDL) у рідинному середовищі. На противагу до малонового диальдегіду та 4-гідроксиноненалу, інші альдегідні продукти ПОЛ є гідрофобними і залишаються в закритій асоціації з LDL, акумулюючись в мілімолярних концентраціях. Альдегіди в цих підвищених рівнях реагують з білковою частиною молекули LDL, яка називається аполіпопротеїн В. Цей протеїн має негативний вплив, здатен до комплексної структурної перебудови, внаслідок чого формуються окислені форми LDL (ох-LDL). Останні невдовзі розпізнаються LDL-рецептором і виявляють різні прозапальні властивості.

Вплив ПОЛ на функцію сперматозоїдів проявляється таким чином:

  • виділення ROS в сім’яну рідину з нейтрофілів або патологічних форм сперматозоїдів може бути причиною непліддя. Високі концентрації пероксиду водню індукують ПОЛ та призводять до загибелі клітини;
  • підвищення продукції ROS сперматозоїдами асоційоване зі зниженням мітохондріального мембранного потенціалу (mitochondrial membrane potential, ММР). У пацієнтів з патологічними параметрами еякуляту суттєво нижчий ММР;
  • неплідні чоловіки мають знижену якість сперми, індуковану високим рівнем ROS в еякуляті. Позитивна залежність виникає між посиленням пошкодження сперматозоїдів під дією ROS та високим рівнем цитохрому C, каспаз 9 та 3, які посилюють апоптоз цих клітин у пацієнтів із чоловічим фактором непліддя;
  • збільшення продукції вільних радикалів впливає на виділення таких сперматозоїдів із зародкових клітин, які проявляють патологічно високі рівні цитоплазматичної ретенції;
  • надмірний вміст ферментів у цитоплазмі, які постачають матеріалом майбутню продукцію ROS редокс-системою плазматичної мембрани сперматозоїдів. Наслідки оксидативного стресу проявляються у зниженні рухливості та запліднюючого потенціалу, індукції пошкодження ДНК та ядра сперматозоїдів;
  • перекис водню прямо діє на функцію сперматозоїдів і є ключовим у процесі запліднення в дозо- і часозалежний спосіб. Його низька концентрація підтримує капацитацію, тоді як висока має згубний вплив і ставить крапку в капацитаційному процесі;
  • сублетальний вплив оксидативного стресу на параметри рухливості асоційований з переміщенням в мембрані сперматозоїдів фосфатидилсерину;
  • оксидативний стрес зменшує пластичність мембрани [12].

Біопозитивні ефекти вільних радикалів реалізуються фізіологічно при диханні мітохондрій в процесі метаболізму клітини тільки за умови, що їхня концентрація є низькою. Вони впливають на метаболізм простаноїдів, регулюють клітинний ріст, опосередковують передачу сигналів всередину клітини. Вільні кисневі радикали відіграють важливу роль в регуляції тонусу судин та антимікробному захисті. Певні представники ROS можуть також фізіологічно впливати на регуляцію функцій сперматозоїдів, зокрема посилювати їхню здатність зв’язуватися із прозорою зоною. Інкубація сперматозоїдів із низькими концентраціями перекису водню посилює капацитацію, гіперактивацію, акросомальну реакцію та здатність проникати в ооцит [12]. Визначення функціональних змін, спричинених ПОЛ мембран сперматозоїдів, є потрібним для кращого розуміння їхньої фізіологічної ролі. Це допоможе виробити нову стратегію у терапії чоловічого непліддя [12].

Ми вивчили оксидативний статус у 155 зразках еякуляту, з них 95 – було взято у здорових чоловіків, а 60 – у неплідних. Неплідні чоловіки були поділені на дві групи: пацієнти з нормозооспермією та інфекціями урогенітального тракту, а також особи з патологічною спермограмою та інфекціями урогенітального тракту. Вивчали різні фази інфекції: тільки з присутністю бактерій, з присутністю бактерій та лейкоцитів, тільки з лейкоцитами, з іншими запальними маркерами. Ми досліджували число лейкоцитів, кількість бактерій. У сім’яній рідині визначали рівень про- і антиоксидантів та окремих прозапальних цитокінів (інтерлейкінів [IL] -1β, IL-6, IL-8, фактора некрозу пухлини α [TNF-α]). Вираховували два окиснозалежних індекси супероксиддисмутаза/ксантиноксидаза (SOD/XO) та каталаза/ксантиноксидаза (CAT/XO) по відношенню до специфічної фази інфекції еякуляту в двох групах пацієнтів. Ми довели, що XO-активність підвищується у пацієнтів з патологічною спермограмою, на відміну від групи з урогенітальними інфекціями та нормозооспермією, де вона знаходилась в межах норми. В останній групі (урогенітальні інфекції і нормозооспермія) окисно-відновні індекси були підвищені, що корелювало з підвищеним вмістом антиоксидантів. Також в цій групі рівень IL-6 був таким же, як і у чоловіків із нормозооспермією без інфекцій. Це можна пояснити тим, що еякулят нормозооспермальних чоловіків краще відновлюється після інфекцій, ніж патологічний. Можливо, рівень секреції IL-6 може допомогти в прогнозуванні одужання [11].

Наші дані переконують, що:

  • урогенітальні інфекції на пізній стадії у нормозооспермальних пацієнтів можуть привести (свого роду зворотний зв’язок) до переважання рівнів ферментів-антиоксидантів (супероксиддисмутаза, каталаза) над прооксидантами (глутатіонпероксидаза, ксантиноксидаза) в сім’яній рідині, створюючи позитивне оточення для повернення повних функцій сперматозоїдам;
  • інфекції урогенітального тракту неплідних чоловіків можуть стати причиною переважання в еякуляті ферментів із прооксидантною дією, що може служити додатковим негативним фактором втрати сперматозоїдами здатності до запліднення і бути поганим прогнозом для майбутньої фертильності;
  • прогноз перебігу запалення та його вплив на функцію сперматозоїдів можна визначати через моніторинг окисно-відновних індексів;
  • суттєве підвищення концентрації IL-6 в сім’яній плазмі нормозооспермальних пацієнтів (навіть якби корисне) може вказувати на присутність інфекційного агента в чоловічому репродуктивному тракті та необхідність призначення антибіотикотерапії;
  • лейкоцити в еякуляті, особливо неплідних чоловіків (з патологічною спермограмою), можуть бути додатковим фактором поганого прогнозу фертильності, що може підтвердити доцільність інтенсивної терапії, яка містить антиоксидантні та антизапальні складові [11].

Ідентифікація генів, що відіграють ключову роль у сперматогенезі В начало статьи

Значну кількість випадків чоловічого непліддя пояснюють ідіопатичною азооспермією або олігозооспермією, які можуть мати генетичний характер. Регуляція складного процесу, яким є сперматогенез, відбувається за участю багатьох генів, що підлягають експресії на різних етапах диференціації клітин – мітотичному, мейотичному та післямейотичному, в процесі яких поділи та дозрівання приводять остаточно до формування сперматозоїдів [5, 13]. Ідентифікація генів, які відіграють ключову роль в сперматогенезі, здебільшого відбувається на морських свинках або мишах, бо у людини це доволі важко зробити з огляду на утруднений доступ до проб тканини з яєчок, а також обмежені можливості дослідження генів у людини. Тому генетичні причини чоловічого непліддя надалі залишаються мало вивченими. Потрібен пошук нових методів, які покращили б ідентифікацію генів, потенційно заангажованих у сперматогенезі, і тим самим оптимізували діагностику, яка є необхідною для правильного вибору лікування неплідних чоловіків.

Експресійні мікроматриці стали важливим дослідницьким знаряддям, яке робить можливим пошук великої кількості генів в рамках геному. Застосування мікроматриць дозволяє ідентифікувати ключові для процесу сперматогенезу гени, їх кореляцію з непліддям, а також виявити потенційні біомаркери, які можуть становити основу для утворення нової діагностичної бази. Одним із перших досягнень, які спираються на аналіз мікроматриці, є список генів, що експресують в гонадах чоловіка і зв’язані з процесом сперматогенезу. Цей список був опублікований 2001 р. [13]. За допомогою мікроматриці Affymetrix U95A було ідентифіковано 85 генів, рівень експресії яких в гонаді (яєчку) чоловіка був значним. Після порівняння з іншими органами їх віднесено до специфічних для чоловічих гонад [14]. При пошуку генів, важливих для сперматогенезу, в т.ч. для плідності, аналізували також сперматозоїди з еякуляту. Значна кількість чоловіків, які характеризуються нормальними параметрами сперми, мають проблеми із заплідненням, а звичайний аналіз еякуляту базується на визначенні кількості, рухливості та морфології сперматозоїдів, що не пояснює причин цих невдач. Відхилення в сперматогенезі, що обмежують плідність, можуть бути виявлені також в транскриптомі сперматозоїдів. Важливим дослідницьким кроком була спроба формування пулу мРНК сперматозоїдів у плідних чоловіків, демонстрація асоціації між профілем РНК у сперматозоїдах і гонаді та вибір генів, ключових у регуляції чоловічої плідності [8]. За допомогою аналізу на мікроматриці ідентифіковано гени, які беруть участь у процесі сперматогенезу і можуть потенційно відігравати роль у неплідді. В одному із початкових досліджень генів, важливих для процесу сперматогенезу, та їх кореляції з чоловічим непліддям спеціалісти опиралися на порівняння профілю експресії генів в тканинах яєчок дорослого та плода. При цьому звертали увагу на гени, які можуть потенційно корелювати з непліддям, а саме: testis specific mitotic centrome-associated kinesin (tsMCAK), RAS-related protein-1A (Rap1A), NYD-SP16, який ще називають spermatogenesis associated 9 (SPATA9), testis pyridoxal kinase (PKH-T), alternative splice variant of bromodomain, testis-specific (BRDT-NY), bubblegumrelated-like (BGR-like). Ген tsMCAK є важливим для сегрегації хромосом під час сперматогенезу і необхідним для проліферації та поділів клітин-попередників сперматозоїдів, а мутація в ньому може призводити до непліддя. Ген NYD-SP16 задіяно у капацитації і акросомальній реакції, підлягає експресії на всіх стадіях клітин сперматогенезу. Показано, що експресія гена NYD-SP16 не виявлялася у пацієнтів із синдромом самих клітин Сертолі (Sertoli cell-only syndrome, SCOS) і блокуванням дозрівання сперматогенезу на його початковій стадії. Однак у пацієнтів зі збереженим сперматогенезом на кожному його етапі експресія була високою, особливо в дорослих сперматогенних клітинах під час сперматогенезу [3, 4, 18].

Показана різниця в рівні експресії генів у групах пацієнтів зі сперматогенними клітинами або без них у яєчку. Це гени deleted in azoospermia-like (DAZL), basonucin (BSN), synaptojanin 2 (SYNJ2), testicular signal transduction and RNA processing (TSTAR), testis specific protein, Y-linked 1 (TSPY1), calmegin (CLGN), bromodomain, testis-specific (BRDT) та protamine (PRM). Вони експресуються в інший спосіб, ніж у пацієнтів із SCOS. У зв’язку з цим визнано, що вони є важливими для гаметогенезу, починаючи з генерації прекурсорних гермінальних клітин, сперматогоніїв, всіх мейотичних поділів та сперматогенезу [7]. Також знайдено інші гени, що експресуються у процесі сперматогенезу, і ця експресія відрізняється у чоловіків з нормальним та патологічним сперматогенезом. Це гени septin 12 (SEPT12), spermatogenesis associated 17 (SPATA17), Leucine-rich repeats and WD repeat domain containing (LRWD1) [9].

Такі гени є потенційними біомаркерами фертильності чоловіків. Сперматогенез – багатоетапний процес, поділений на три фази: мітотичну, мейотичну та власне сперматогенез, тому клітини на різних етапах своїх поділів проявляють різний профіль експресії генів. Ключовими дослідженнями у виділенні генів, важливих на кожному етапі сперматогенезу, були такі, в яких порівнювали групи пацієнтів плідних з неплідними, що характеризувалися різним ступенем порушення сперматогенезу. Таким чином виділено гени, потенційно важливі для реалізації фази власне сперматогенезу і які можуть бути біомаркерами для визначення типу непліддя. За допомогою мікроматриці комплементарної ДНК (сDNA) визначено групу генів, експресія яких була різною в контрольній групі з повноцінним сперматогенезом та в групі пацієнтів з аплазією сперматогенних клітин та/або їх повною відсутністю. На премейотичному та мейотичному рівнях більш сильній експресії підлягають гени із сімейства deleted in azoospermia (DAZ) та testis specific protein, Y-linked 1 (TSPY), натомість післямейотично збільшену експресію показують гени: protamine 2 (PRM2), transition protein 1 (TNP1) та zona pellucida binding protein (ZPBR) – основні відповідальні за формування та правильне функціонування сперматозоїда [6]. У пацієнтів із мікроделецією фактора азооспермії (azoospermiafactor, AZF) також виділено кілька післямейотичних генів, таких як Outer dense fiber of sperm tails (ODF), TNP1 та PRM2, які є важливими для правильного формування сперматозоїда. Їх експресія була суттєво зниженою в обстежуваній групі, яка характеризувалася нестачею післямейотичних клітин, що вказує на їх важливість на цьому етапі сперматогенезу.

Ідентифікацію післямейотичних генів проводила також група китайських вчених, які вивчали експресію генів від десяти здорових добровольців. Ці спеціалісти ідентифікували групу генів, задіяних в капацитації, рухливості сперматозоїдів та взаємодії з яйцеклітиною: A kinase anchor protein 4 (AKAP4), T-complex protein 11 homolog (TCP11), CLGN, member of the heat shock protein 110 family (APG-1), outer dense fiber of sperm tails 2 (ODF2), lactate dehydrogenase (LDHC) [15].

Дослідження експресії генів у плідних та неплідних чоловіків здійснили революцію у попередніх підходах до її вивчення. Завдяки експресійним мікроматрицям ми отримали багато інформації щодо генів, задіяних в процес сперматогенезу, а також потенційно корелюючих з чоловічим непліддям, його підтипами. За допомогою добре гістопатологічно охарактеризованих груп пацієнтів вдалося ідентифікувати гени, що експресують на різних етапах формування гамет і можуть використовуватися як біомаркери для оптимізації діагностики та лікування непліддя.

Висновки В начало статьи

1. Для оцінки ризику репродуктивних невдач у пацієнтів з транслокаціями пропонується аналіз мейотичних сегрегацій у сперматозоїдах.

2. Надзвичайно важливими в прогнозуванні фертильності чоловіка є оцінка рівня бактеріального забруднення його еякуляту і проведення лабораторного визначення окисно-відновних індексів.

3. Чоловікам зі зниженою або відсутньою фертильною функцією рекомендується проводити гістопатологічне дослідження біоптату яєчок для виявлення можливих причин порушення сперматогенезу і при можливості здійснювати генетичний аналіз біологічного матеріалу на експресійних мікроматрицях.

Термінологічний словник [1, 2] В начало статьи

Акросомальна реакція – це ключовий етап взаємодії гамет, який закінчується їх злиттям. Вона розпочинається пенетрацією сперматозоїда прозорої зони яйцеклітини та його проникненням через мембрану ооцита (яйцеклітини). Сперматозоїд, нездатний до виконання акросомальної реакції, не може запліднити яйцеклітину. Сперматозоїд повинен зв’язатися із прозорою зоною яйцеклітини двома різними рецепторами на своїй мембрані: перший – це G1-зв’язуючий рецептор, який активує фосфоліпазу Сβ1; другий – рецептор до тирозинкінази, який зв’язує фосфоліпазу Сγ. Зв’язування з рецепторами повинно активувати аденілатциклазу, що повинно привести до підвищення цАМФ та активації протеїнкінази. Остання активує залежний від насичення Са2+ канал в зовнішній акросомальній мембрані, що сприяє вивільненню Са2+ з внутрішнього вмісту акросоми до цитозолю. Це перший, відносно невеликий підйом рівня Са2+, який приводить до активації фосфоліпази Сγ. Продукт гідролізу фосфатидилінозитол-бісфосфату приводить до переміщення протеїнкінази в плазматичну мембрану та її активації. Протеїнкіназа відкриває залежний від насичення Са2+ канал в плазматичній мембрані, що спричиняє другий підйом Са2+. Отже, протеїнкіназа активує фосфоліпазу А2 з продукцією арахідонової кислоти з фосфоліпідів мембрани. Перегрупування останніх у мембрані сперматозоїда дозволяє йому міцно зафіксуватися на яйцеклітині та проникнути в неї.

Балансуюча (зрівноважена) транслокація. Каріотип, який має весь набір генів, але їхнє розташування в межах хромосом відрізняється від нормального, називають збалансованим за хромосомними змінами. Фенотип є нормальним, але буде спостерігатися часткова анеуплодія у певній кількості відсотків статевих клітин з певним ризиком утворення незбалансованих нащадків.

Взаємозамінність при транслокації – відновлення хромосом після розриву з неправильним розміщенням сегментів.

Вільні кисневі радикали (reactive oxygen species, ROS) – короткоживучі хімічні речовини-посередники, що містять один або більше неспарених електронів, які обертаються навколо осі. Це високореактивні та окислені ліпіди, амінокислоти та карбогідрати, які спричиняють мутації ДНК. Підвищена кількість ROS може утворюватися в живому організмі. Це відбувається за кількома механізмами: біоактивація ксенобіотиками, іонізуюча радіація, запалення клітин, посилений клітинний метаболізм, декомпартменталізація та транспорт іонів металу, активація оксидаз та оксигеназ, втрата антиоксидантних властивостей.

Інверсія – зміна лінійної послідовності генів на хромосомі внаслідок перевертання тієї чи іншої її ділянки.

Каталаза (catalase, CAT) – ензим, що має антиоксидантну активність, тобто інгібує дію вільних кисневих радикалів.

Ксантиноксидаза (хanthine oxidase, XO) – ензим класу оксидоредуктаз, що за певних умов перетворюється на форму, яка може відновлювати молекулярний кисень. Має прооксидантну активність.

Ліпіди мембран сперматозоїдів – головна складова частина біліпідного шару мембрани, відповідальна за її пластичність та зміни у складі плазматичної мембрани сперматозоїдів, починаючи від епідидимального дозрівання і закінчуючи їх капацитацією у жіночому репродуктивному тракті (задіяні також у процес проникнення сперматозоїда у яйцеклітину).

Мікроматриці експресійні – це метод визначення одночасно експресії багатьох тисяч генів у досліджуваному зразку. На малій планшетці зафіксовані молекулярні зонди, які відповідають послідовностям (секвенціям) певних генів. Пул матричної (кодуючої) РНК досліджуваного зразка переписується на стабільніші молекули, тобто комплементарну ДНК (cDNA), мітиться, а потім гібридизується із зондами, що знаходяться на планшетці. Після гібридизації планшетку поміщають у спеціальний прилад для сканування зображення. Наступним кроком є біоінформаційний аналіз, який проводиться на основі оцінки інтенсивності світіння міченої комплементарної ДНК і демонструє різницю в рівні експресії генів між досліджуваними пробами по відношенню до фону. Цей метод може бути використаний для виявлення різниці в експресії генів в тканині (наприклад яєчка), взятій від хворого до і після лікування.

Пробанд – уражена особа, яку розглядають незалежно від родичів при генетичному дослідженні; від неї починають аналіз родоводу.

Продукти перекисного окислення ліпідів (ПОЛ).Найбільш відомим (але не найбільш важливим) продуктом ПОЛ є малоновий диальдегід (MDA). Є також багато продуктів ПОЛ, наприклад: дієнові кон’югати та вторинні продукти перекисного окислення, такі як кетони, оксо- та гідроксикислоти, та насичені і ненасичені гідрокарбони (етан, пентан). Найвідомішим з них є біологічно активний 4-гідроксиноненал, який може спричинити різні пошкодження клітин – впливає і на білки, і на ДНК без втрати їхнього генетичного матеріалу. Він є хемоатрактантом для поліморфноядерних лейкоцитів в пікомолярних концентраціях, інгібує проліферацію клітин та є мутагенним.

Реципрокна (взаємна) транслокація (reciprocal chromosomal translocations, RCT) – взаємний обмін сегментами між двома розірваними негомологічними хромосомами. Тобто змінюється розташування генів, але не весь генетичний матеріал. Реципрокні (взаємні) транслокації можуть спричинити певні хромосомні синдроми. Прийнято вважати, що цей феномен пов’язаний з ефектом положення генів. Феномен ефекту положення генів полягає в тому, що гени, які опинилися поблизу точок розриву хромосом при формуванні збалансованої аномалії, змінюють свої прояви, тобто в одному оточенні генів їх функція збережена, а в іншому – порушена.

Під час мейозу хромосоми в балансуючих реципрокних транслокаціях доводять свої гомологічні сегменти до квадривалентної форми, які можуть сегрегувати (збиратися, складатися) п’ятьма різними шляхами: почерговим (продукція нормальних або балансуючих гамет), суміжним I, суміжним II, 3:1 і 4:0 (в останніх чотирьох комбінаціях продукуються тільки незбалансовані гамети). В окремих носіїв реципрокних транслокацій певна пропорція сперматозоїдів має каріотип, який є наслідком специфічних типів мейотичних сегрегацій і містить так звані сегрегаційні структури.

Вкрай важливо виявляти збалансовані транслокації, адже нерідко діти, які їх мають, є фенотипічно нормальними, але їхні нащадки мають високий ризик незбалансованих перебудов. Незбалансованою називається така транслокація, яка відбувається, наприклад, між двома акроцентричними хромосомами з утратою ними коротких плечей та утворенням однієї метацентричної хромосоми. Така транслокація називається робертсонівською.

Сегрегація: сегрегація 1 – розходження алельних генів під час мейозу, при якому гомологічні хромосоми починають мігрувати до полюсів клітини, в результаті чого члени кожної пари алельних генів потрапляють в окремі гамети; сегрегація 2 – розподіл різних елементів популяції; сегрегація 3 – прогресуюче розмежування на різні ділянки в зиготі ембріона, що формується.

Супероксиддисмутаза (superoxide dismutase, SOD). Зміни, які відбуваються в гранулоцитах (в основному нейтрофілах) після поглинання патогенного мікроорганізму, спрощено можна представити так: відбувається активація НАДФ-оксидази, яка зв'язана з цитохромом В558. НАДФ-оксидаза каталізує виникнення аніонної сполуки кисню О•-2. Внаслідок спонтанної дисмутації або дисмутації, каталізованої супероксиддисмутазою, з цієї сполуки виникає перекис водню, частина якого потім розкладається каталазою на кисень та воду. Загалом супероксиддисмутаза володіє антиоксидантними властивостями.

Синдром Патау (Patau) – зустрічається у трьох цитогенетичних варіантах: проста трисомія, робертсонівська транслокація і мозаїчні форми з різним відсотком клітин патологічного клону. Популяційна частота становить 1:7800. Фенотипічно: мікроцефалія, полідактилія, вади розвитку внутрішніх органів. Геніталії – крипторхізм, гіпоспадія, гіпоплазія зовнішніх статевих органів.

Синдром самих клітин Сертолі – один із видів чоловічого непліддя, при якому спостерігається нестача гермінальних клітин у сім’ятворчих канальцях, однак є відповідна кількість клітин Сертолі.

Транслокація (перебудова) – структурна хромосомна аберація, в якій один сегмент хромосоми переміщується до негомологічної хромосоми, в результаті розриваються обидві хромосоми, потім відновлюються, але з неправильним розміщенням. При цьому відбувається обмін генетичним матеріалом. Вони бувають збалансованими і незбалансованими.

Транскриптом – це форма молекул РНК, що з'являється в клітині під час транскрипції – синтезу матричної РНК. У залежності від часу, середовища і факторів, які діють на клітину, транскриптом підлягає змінам. Транскриптом в основному використовується для визначення рівня експресії генів за допомогою техніки мікроматриці у відповідному методі (в тканині чи клітинах).

 

Література

1. Гречаніна О.Я. Медична генетика / Гречаніна О.Я., Богатирьова Р.В., Волосовець О.П.– К.: Медицина. – 2007. – 534 с.

2. Дорланд І. Ілюстрований медичний словник – українське видання / Дорланд І. – Л.: Видавничий дім «Наутілус», 2003. – 2688 с.

3. Cheng L.J. NYD-SP16, a Novel Gene Associated with Spermatogenesis of Human Testis / Cheng L.J., Li J.M. / Biol Reprod. – 2003. – 68. – Р. 190-198.

4. Cheng L.J. Expression of novel HsMCAK mRNA splice variant, tsMCAK gene, in human testis / Cheng L.J., Zhou Z.M. // Life Science. – 2002. – № 71. – Р. 2741-2757.

5. Ellis P. Coordinated transcriptional regulation patterns associated with infertility phenotypes in men / Ellis P., Furlong R. // Journal of medical Genetics. – 2007. – № 44. – Р. 498-508.

6. Feig C. A new paradigm for profiling testicular gene expression during normal and disturbed human spermatogenesis / Feig C., Kirchhoff C. // Molecular Human Reproduction. – 2007. – №13 (1). – Р. 33-43.

7. Fox M. Feasibility of global gene expression analysis in testicular biopsies from infertile men / Fox M., Ares V.X. // Molecular Reproduction and Development. – 2003. – № 66. – Р. 403-421.

8. Garrido N. Microarrey analysis in sperm from fertility and infertile men without basic sperm analysis abnormalities reveals a significantly different transcrioptome / Garrido N., Martinez-Conejro J.A. // Fertility and Sterility. – 2009. – № 91 (4). – Р. 1307-1310.

9. Lin Y.-H. Identification of ten novel genes involved in human spermatogenesis by microarray analysis of testicular tissue / Lin Y.-H., Lin Y.-M. // Fertility and Sterility. – 2006. – № 86 (6). – Р. 1650-1658

10. Midro A.T. Risk Evaluation of Carriers With Chromosome Reciprocal Translocation t(7;13)(q34;q13) and Concomitant Meiotic Segregation Analyzed by FISH on Ejaculated Spermatozoa / Midro A.T., Wiland E., Panasiuk B., Lesniewicz R. et al. // American Journal of Medical Genetics. – 2006. – №140A. – Р. 245-256.

11. Sanocka D. Male genital tract infection: an influence of leukocytes and bacteria on semen / Sanocka D., Fraczek M., Jedrzejczak P., Szumala-Kakol A. et al. // Journal of Reproductive Immunology. – 2004. – № 62. – Р. 111-124.

12. Sanocka D. Reactive oxygen species and sperm cells / Sanocka D., Kurpisz M. // Reproductive Biology and Endocrinology. – 2004. – 2,12. – Р. 1-7.

13. Sha J. Identification of testis development and spermatogenesis-related genes in human and mouse testes using cDNA / Sha J., Zhou Z. // Mol. Hum. Reproduction. – 2001. – № 8 (6). – Р. 511-517.

14. Su A. Large-scale analysis of the human and mouse transcriptomes / Su A., Cooke M. // PNAS. – 2002. – № 99 (7). – Р. 4465-4470.

15. Wang H. A spermatogenesis-related gene expression profile in human spermatozoa and its potential clinical applications / Wang H., Zhou Z. // Journal of Molecular Medicine. – 2004. – № 82. – Р. 317-324.

16. Wiland E. Successful pregnancy after preimplantation genetic diagnosis for carrier of t(2;7)(p11.2;q22) with high rates of unbalanced sperm and embryos: a case report / Wiland E., Hobel C.J., Hill D., Kurpisz M. // Prenatal Diagnosis. – 2008. – № 28. – Р. 36-41.

17. Wiland E. The Analysis of Meiotic Segregation Patterns and Aneuploidy in the Spermatozoa of Father and Son With Translocation t(4;5)(p15.1;p12) and the Prediction of the Individual Probability Rate fir Unbalanced Progeny at Birth / Wiland E., Midro A.T., Panasiuk B., Kurpisz M. // Journal of Andrology. – 2007. – № 28. – Р. 262-272.

18. Ying Lu Human testicular protein NYD-SP16 is involved in sperm capacitation and acrosome reaction / Ying Lu, Huo R. // Fertility and Sterility. – 2006. – № 86, suppl.3. – Р. 1228-1234.

 

В начало статьи

 

Поділитися з друзями: