Topics: Reproduction

Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с различными нарушениями сперматогенеза

pages: 74-77

Веропотвелян Н.П., канд.мед.н, глав. врач Погуляй Ю.С. Журавлева С.А. Веропотвелян П.Н., канд.мед.н, заведующий отделением отделение патологии репродуктивной функции человека Кодунов Л.А. заведующий отделением > отделение пренатальной диагностики, ОКУ «Межобластной центр медицинской генетики и пренатальной диагностики», г. Кривой Рог

 

Возможные генетические причины мужского бесплодия

Роль Y-хромосомы в процессе сперматогенеза

Диагностика микроделеций AZF-локуса

Клиническая картина при микроделециях Y-хромосомы

Материалы и методы исследования

Результаты

Обсуждение

Заключение

 

Обзор статистических данных по изучению репродуктивной функции в человеческой популяции по всему миру показал, что 2-7% супружеских пар являются бесплодными [1, 2]; согласно данным Emmet J. Lamb (1994), среди американских пар – от 10 до 20% [3].

По оценкам ВОЗ, эта цифра достигает 15% (60-80 млн пар). При этом первичное бесплодие наблюдается у 30% супругов [4].

Исследования 3956 бесплодных пар в семи лабораториях мира показали, что мужское бесплодие наблюдается в 40% случаев [1]. Согласно отчету по проведенным исследованиям в 33 центрах 25 стран мира, 10,7% мужчин в бесплодных браках имеют азооспермию или олигозооспермию [2, 5].

Результаты первичного медицинского обследования и спермиологического анализа позволяют дать предварительную оценку причины нарушения репродуктивной функции у мужчины. Обычно мужское бесплодие классифицируют на основе результатов спермограммы.

В 2010 г. ВОЗ переиздала стандартный протокол для исследования бесплодных пар. Согласно этим рекомендациям, нормальные показатели спермограммы должны быть следующими: количество сперматозоидов 15 × 106/мл, из которых больше 40% подвижны, больше 58% живые, около 4% с нормальной морфологией, при этом не должно содержаться более чем 1 × 106/мл лейкоцитов [6].

Нарушения сперматогенеза могут быть обусловлены разными причинами: воспалительными заболеваниями половых органов, недоеданием, эндокринологическими расстройствами, влиянием неблагоприятных факторов окружающей среды, аллергизацией, широким и бесконтрольным применением лекарственных препаратов, злоупотреблением алкоголем, курением, а также генетическими дефектами [7, 8].

Генетические дефекты (мутации и хромосомные аномалии) наблюдаются в 30% случаев мужского бесплодия [2, 9].

Возможные генетические причины мужского бесплодия В начало статьи

При изменении нормальной функции генетического аппарата, связанного с мутациями мужского генома, нарушения могут возникать на разных уровнях: при формировании половых органов, сперматогенезе, созревании сперматозоидов в придатках, их транспорте в репродуктивном тракте и эякуляции, проникновении через цервикальную слизь, капацитации, акросомальной реакции, оплодотворении яйцеклетки и т.д. [10].

Хромосомные аномалии, которые обусловливают бесплодие, делятся на два типа: изменение кариотипа в соматических и половых клетках и мейотические нарушения.

Частота нарушения кариотипа у бесплодных мужчин составляет около 7% (De Breakelur and Dao,1991). Хромосомные аномалии чаще выявляют у пациентов с азооспермией – в 13,7% случаев (большую часть составляет синдром Клайнфельтера) (Foresta et al., 2002; Калантари П. и др., 2003). Аномалии половых хромосом преобладают у мужчин с азооспермией, аномалии аутосом – у пациентов с олигозооспермией (Foresta et al., 2002) [4].

Мейотические нарушения наблюдаются у 6% мужчин (Egozcue et al., 1983; De Breakelur and Dao,1991), и эта частота повышается до 17,5% у лиц с олигозооспермией (≤ 1 × 106/мл) (Vendrell et al., 1999).

На сегодняшний день уже известно множество генов (A-MYB, AZH, BCLW, HPY, LVS и др.), расположенных на разных хромосомах, которые отвечают за процесс сперматогенеза. И нарушение этого процесса обусловлено большим количеством мутаций в генах-координаторах [2].

Однако намного раньше была открыта главенствующая роль Y-хромосомы в процессе сперматогенеза.

Роль Y-хромосомы в процессе сперматогенеза В начало статьи

Долгое время Y-хромосома считалась функционально инертной, и контроль за детерминацией пола (ген SRY) считался единственно важной функцией данной части генома (Hamilton, 1967). Тем не менее эта теория была опровергнута, когда произошло открытие участка Y-хромосомы, отвечающего за сперматогенез.

Впервые роль делеций локуса Yq11 в этиологии нарушения сперматогенеза и бесплодия у мужчин была показана в 1976 г. Tiepolo и Zuffardi [11].

У шести мужчин с азооспермией была обнаружена делеция всего гетерохроматина дистального участка длинного плеча Y-хромосомы (Yq), и азооспермия при этом была единственным симптомом [2].

Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили с помощью STS-технологии (sequence-tagged sites) построить детальную картину Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала [12].

Было подтверждено наличие в дистальной части длинного плеча Y-хромосомы локуса azoospermia factor (AZF), делеции которого ответственны за нарушение сперматогенеза (рис.1).

ris1.jpg
Рис. 1. Карта Y-хромосомы с указанием ее локусов и некоторых генов [7]

В 1996 г. Vogt et al. на основе полученных данных о локализации и размере делеций, выявленных у 26 мужчин, предложили выделить в локусе Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc [7]. Позже был открыт четвертый регион (AZFd), который был отнесен к AZFc-региону [13].

Впоследствии для каждого субрегиона были выделены кандидатные гены, ответственные за нарушение сперматогенеза: для AZFa – USP9Y (DFFRY) и DBY (dead box on the Y), для AZFb – RBMY, AZFc-региона – DAZ (deleted in azoospermia) [11].

Функции вышеперечисленных генных семейств пока досконально не изучены, однако уже известно, что все они кодируют РНК-связывающие белки.

Диагностика микроделеций AZF-локуса В начало статьи

Еще несколько лет назад анализ AZF-региона выполнялся в экспериментальных целях. После расшифровки строения AZF-локуса и применения ПЦР-технологии анализ микроделеций Y-хромосомы стал популярным и широко распространенным.

Для стандартизации данного вида исследований в 1999 г. было создано руководство Laboratory guidelines for the molecular diagnosis of Y-chromosomal microdelesion (EMQN).

Согласно данному руководству, набор ПЦР-праймеров для диагностики микроделеций Y-хромосомы должен охватывать следующие STS-сайты: SY14 (SRY), ZFX/ZFY, SY84, SY86, SY127, SY134, SY254, SY255.

При таком подходе в разных исследованиях частота микроделеций AZF-локуса варьировала от 1 до 35%, что объясняется различными критериями отбора пациентов [12].

Клиническая картина при микроделециях Y-хромосомы В начало статьи

Делеции AZF-локуса связаны с различной степенью нарушения сперматогенеза – от умеренного снижения его активности (гипосперматогенез) или блока сперматогенеза до практически полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах – синдром клеток Сертоли (СКС) [11, 20].

Делеции в локусе AZF могут быть полными, т.е. целиком удаляющими один AZF-регион или более, и частичными, если делеции не полностью захватывают какой-либо из трех его регионов. Практически во всех случаях полные делеции являются мутациями de novo и приводят к азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени [14].

Строгой зависимости степени и стадии нарушения сперматогенеза от локализации и размера делеций локуса AZF обнаружено не было, однако ряд общих генофенотипических корреляций удалось выявить [11, 13].

Делеции AZFa и AZFb-регионов обусловливают азооспермию в 2/3 случаев и более редко фенотипически проявляются в виде олигозооспермии. При гистологическом исследовании тканей яичек AZFa-делеция всегда проявляется как СКС. Основываясь на этом, ученые полагают, что гены AZFa-региона регулируют первые фазы сперматогенеза или активность стволовых клеток.

Вариабельные нарушения сперматогенеза при делециях AZFb-региона свидетельствуют о множественной функциональной активности RBMY-гена или его комбинаторной активности с другими генами.

Следовательно, пациентам с делециями AZFa и AZFb-субрегионов, которые ассоциированы с невозможностью получения зрелых половых клеток (при проведении диагностической биопсии получить сперматозоиды невозможно), необходимо рекомендовать иные пути решения репродуктивных проблем – донорские программы или усыновление [15].

Анализ литературы показал, что делеции AZFc могут ассоциироваться с азооспермией (54%) и тяжелой олигозооспермией (46%); гистологическая оценка тканей яичка варьирует от СКС до гипосперматогенеза. При этом канальцы с различными дефектами могут быть найдены у одного и того же индивидуума. Также считается возможным, что тестикулярные повреждения, обусловленные делецией AZFc, могут прогрессировать, и у пациентов с олигозооспермией с возрастом может развиться азооспермия. Однако у мужчин с AZFc-делециями примерно в 71% случаев удается получить зрелые сперматозоиды, пригодные для искусственного оплодотворения [14].

Вариабельный фенотип, который наблюдается при делеции AZFb и AZFc-регионов, может быть объяснен посредством следующих гипотез.

  1. Различная величина делеций.

Делеции могут затрагивать целый AZFb- или AZFc-регион либо они могут быть минимальными, захватывающими только один ген, генный кластер или несколько STS-маркеров. При этом предполагается, что тяжесть фенотипических проявлений напрямую зависит от величины делеции. Однако отдельные случаи опровергают данную гипотезу [13].

  1. 2. Роль гомологичных генов и генетического фона.

Каждый AZF-ген имеет гомолога на Х-хромосоме (DBX, USP9X, RBMX) или на аутосомах (DAZL1). Участие гомологов в процессе сперматогенеза не наблюдается, однако можно предположить, что их экспрессия меняется при делециях на Y-хромосоме. Генетический фон (другие гены семейства) также может модифицировать фенотипический эффект имеющихся делеций [13].

В настоящее время для мужчин с тяжелой формой олигозооспермии единственно эффективным методом преодоления бесплодия является метод Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) – введение сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки, а для пациентов с азооспермией – ICSI в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов с помощью TESA или TESE (производят биопсию яичка и из полученной ткани выделяют сперматозоиды, которыми позже оплодотворяют яйцеклетку) [16].

В ряде случаев использование современных вспомогательных репродуктивных технологий позволяет иметь собственных детей мужчинам, несущим делеции Y-хромосомы. Однако следует отметить наличие у них риска передачи данной делеции Y-хромосомы (в 100% случаев), а также повышенного риска рождения детей с мозаицизмом 45,Х0/46,ХY [11, 17].

Материалы и методы исследования В начало статьи

Для исследования было отобрано 218 мужчин в возрасте от 26 до 45 лет, проживающих в областях Центрального и Юго-Восточного регионов Украины, которые обратились в наш центр в связи с нарушением фертильности. В выборку вошли только мужчины с нормальным кариотипом.

Все пациенты были разделены на три группы. Первую группу составили 70 мужчин с азооспермией; во вторую группу отобраны 72 пациента с олигозооспермией различной степени тяжести; в третью – 76 лиц с другими формами патозооспермии.

Исследования на наличие микроделеций AZF-локуса Y-хромосомы проводили методом ПЦР с детекцией путем электрофореза в 2% агарозном геле (наборы GenPak AZF PCR test ООО «Лаборатория Изоген», Москва).

Для диагностики использовались образцы ДНК, выделенные из крови. Кровь получали методом венепункции в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом (раствор ЭДТА).

analiz-Mikrodeletziy_ris_2_big.jpg
Рис. 2. Обнаружение микроделеций Y- хромосомы в локусе YqAZF. Мультиплексная ПЦР

ДНК была выделена с использованием наборов для выделения ДНК Diatom DNA Prep 200 и Magna DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория Изоген», Москва).

ПЦР проводили на программируемом термоциклере Gene Amp PCR System 2700 производства фирмы Applied Biosystems (США).

Для анализа использовались следующие STS-маркеры: sY238, sY84, sY127, sY14, sY86, sY255, sY254, sY134 (рис. 2).

Результаты В начало статьи

Среди 218 обследованных микроделеции локуса AZF были обнаружены у 25 (11,5%) пациентов. В группе мужчин с азооспермией делеции были отмечены у 18 (25,7%) лиц, в группе с олигозооспермией тяжелой степени – у четырех (5,5%). В группе пациентов с другими формами патозооспермии делеции выявлены у троих пациентов (3,9%), причем во всех случаях фенотипическим проявлением была астенозооспермия. Наиболее высокий показатель наблюдался для делеций AZFb+c (42%); 31% составили делеции AZFb-региона; 15% – AZFс-региона; 12% – AZFа-региона.

У всех пациентов с делециями AZFа и AZFb-регионов отмечалась азооспермия. У мужчин с делецией AZFс выявлена азооспермия и олигозооспермия (3 и 1 случай соответственно).

При делециях AZFb+с наблюдались все типы нарушения сперматогенеза (азооспермия 45,5%; олигозооспермия 27,3%; астенозооспермия 27,2%).

Обсуждение В начало статьи

Большинство работ сфокусировано на обследовании мужчин с азооспермией и олигозооспермией (средняя частота составляет 10,5%). Так, полученные в ходе нашего исследования данные вписываются в рамки общемировой статистики.

Распространенность делеций растет при более строгом отборе пациентов: в группе мужчин с олигозооспермией (безвыборочно) – 2,9 и 11,6% при таком отборочном критерии, как идиопатическая олигозооспермия; среди мужчин с азооспермией (безвыборочно) – 7,3%, а при обструктивной азооспермии – 10,5 и до 18% в случае только идиопатических форм [13]. При этом частота делеций AZFa, AZFb и AZFc различна.

По данным анализа, проведенного Forresta et al., делеции AZFc-региона наблюдаются в 59,6% случаев; AZFb – в 15,8% и только 4,9% случаев составляют делеции AZFa-региона.

Большие делеции, включающие два или три региона, обнаруживаются у 13,6% пациентов, хотя при этом 6% делеций выявляются в регионах, не перекрывающих AZF-интервалы.

Распределение по классам микроделеций в случае нашего исследования оказалось несколько иным. Чаще всего встречались делеции AZFb+c и AZFb (в сумме – 73% всех выявленных микроделеций) с различными фенотипическими проявлениями. Превышение частоты делеций AZFb+c также отмечено и в Западном регионе Украины (Макух Г.В., 2012) [21].

Это может объясняться как специфичностью группы выборки, так и, возможно, является популяционной характеристикой Центрального и Юго-Восточного (Днепропетровская, Кировоградская, Черкасская, Херсонская и Николаевская области), а также Западного регионов Украины, что требует дальнейшего изучения.

Заключение В начало статьи

Как показывают многочисленные исследования, одним из наиболее сложных вопросов в области исследований AZF-микроделеций остается выяснение генофенотипических корреляций.

Основной проблемой является клиническое ведение пациентов с делециями локуса AZF. При этом необходимо учитывать не только факт наличия делеции с ее определенным фенотипическим проявлением, но и возможное прогрессирование в сторону ухудшения показателей спермограммы, а также уровень гормонов (в частности уровень фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови при делециях может быть снижен, а ингибина В – повышен) [11, 18].

Также имеются данные, что патоспермия может быть причиной невынашивания беременности [22], что, по-видимому, требует расширения спектра показаний для обследования мужчин на наличие микроделеций Y-хромосомы.

Необходимо учитывать, что большинство микроделеций AZF-локуса представляют собой мутации de novo, однако известно о случаях передачи Y-микроделеций от отца к сыну [11]. В ряде случаев размер делеции у сына с бесплодием был больше, чем у отца [19].

Результаты исследований Y-хромосомы человека свидетельствуют о том, что ее палиндромная область, располагающаяся в локусе AZF, является наиболее сложноустроенным участком во всем геноме человека в отношении протяженных блоков повторяющихся участков (ампликонов), значительно варьирует по составу и композиции повторов и имеет одну из самых высоких частот мутаций [14].

На сегодняшний день диагностика микроделеций Y-хромосомы не только позволяет выяснить причину определенных нарушений репродуктивной функции мужчины, но и избежать неэффективного и дорогостоящего лечения, а также является решающим фактором при применении репродуктивных технологий.

Популяризация молекулярно-генетических исследований в данной области способствует широкому охвату пациентов и позволяет делать такую диагностику скрининговой для мужчин с нарушением сперматогенеза. Поэтому всем пациентам с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени, а также тем, которым планируется программа экстракорпорального оплодотворения, в рамках комплексного клинико-генетического обследования необходимо обязательное проведение анализамикроделеций Y-хромосомы и последующего медико-генетического консультирования [11].

 

Литература

1. Spira A. Epidemiology of human reproduction// Hum. Reprod.- 1986.- P.111-115.

2. Kun Ma, Con Mallidis. The role of Y chromosome deletion in male in fertility//Eu.jornal of endocrinology. – 2000.

3. Human reproductive ecology. Interactions of Environment, Fertility, and Behavior// Annals of The New York Academy of Science

4. Денисенко С.В., Дарий А.С. Генетика репродукции: Киев. - 2008.

5. Camhaire FH, de Kretser D. Towards more objectivity in diagnosis and management of male infertility// Diagnosis and treatment of infertility. – 1982 . – P/1-33.

6. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Third edition//World Health Organization .-1992. – P.44.

7. Skakkeback NE. Patogenesis and management of male infertility//Lancet.- 1994. – P.1473-1479.

8. О. Д. Никитин. Мужской фактор бесплодного брака: состояние проблемы// Здоровье женщины.- №10.-2009.-с.173-177.

9. Bhasin S.Ma & de Kretse DM. Y-chromosome microdeletions and male infertility// Annals of Medicine .- 1997.-P.261-269.

10. Э.В. Вартанян, А.Н. Петрин, Т.Р.Курносова. Генетические факторы мужского бесплодия// Проблемы репродукции . – 2012. -№2.

11. Черных В.Б. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований// Мед. ген. – 2003. -№8. – Т.2. –С.367-379.

12. Vollrath D.The Human Y chromosome:a 43-interval map based on naturally occurring deletions// Science. – 1992. - P.52-59.

13. Foresta C. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis// University of Padova. Italy.

14. В.Б.Черных. AZF делеции – частая генетическая причина бесплодия у мужчин: современное состояние исследований. // Проблемы репродукции.-№1.-2009.-с.10-15.

15. В.Б.Черных, Л.Ф.Курило, В.А.Поляков. Y- хромосома, AZF-микро- делеции и идиопатическое бесплодие у мужчин (обзор литературы)// Проблемы репродукции.-№5.-2001.

16. Гоголевский П.А. с соавт. AZF- микроделеции и мужское бесплодие// Андрология и генитальная хиургия. -2001. -№4. –С. 73-77.

17. Kent-First M.G. et al. The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions and their infertile fathers//Mol.Hum.Reprod. – 1996. –P.943-949.

18. Foresta C.,Ferling A. Deletion and expression analysis of AZFa genes on the human Y chromosome revealed a major role for DBY in male infertility// Hum.Mol.Genet. – 2000. – P.1161-1169.

19. Van Golde R.J. Decreased fertilization rate and embryo quality after ICSI in oligozoospermic men with microdeletios in the azoospermia factor region of the Y chromosome// Hum.Reprod. – 2001. -№2 .-P.289-292.

20. Гоголевский П.А., Гоголевская И.К. Y- хромосома и мужское бесплодие (обзор литературы)// Проблемы репродукции. – 1999. -№5 . –Т5. –С.26-34.

 

В начало статьи

 

Our journal in
social networks:

Issues Of 2012 Year

Contents Of Issue 4 (6), 2012

  1. Пасєчніков С.П., Мітченко М.В., Нашеда С.В.

  2. Князькова И.И.

  3. Чінов Г.П., Нагорний О.Є.

  4. Литвинець Є.А., Антонів Р.Р.

  5. Переверзев А.С.

  6. Чінов Г.П., Нагорний О.Є.

Contents Of Issue 3 (5), 2012

  1. Переверзев А.С.

  2. Веропотвелян Н.П., Погуляй Ю.С., Журавлева С.А. и др.

  3. Грачева О.О., Литвак Е.О.

  4. Юрах А.Е., Романенко А.М.

  5. Пасєчніков С.П., Мітченко М.В., Нашеда С.В.

  6. Поворознюк М.В.

Contents Of Issue 2 (4), 2012

  1. Пасєчніков С.П., Глєбов А.С.

  2. Пасєчніков С.П., Клименко Я.М.

  3. Пасєчніков С.П., Мітченко М.В., Нашеда С.В.

  4. Іванов Д.Д., Кушніренко С.В.

  5. Гаврилюк А.М., Наконечний А.Й.

  6. Переверзев А.С.

  7. Банира О.Б., Строй О.О., Шуляк О.В.

Contents Of Issue 1 (3), 2012

  1. Підмурняк О.О., Собчинський С.А., Войцешин В.В. та ін.

  2. Кубанський С.А.

  3. Переверзев А.С.

  4. Вайсерман А.М.

  5. Гаврилюк А.М., Наконечний А.Й.

  6. Серняк Ю.П., Криштопа М.В., Фуксзон А.С. и др.

  7. Пасєчніков С.П., Мітченко М.В., Нашеда С.В.

  8. Прийма О.Б., Кульчинський А.Б., Кульчинська Г.Л. та ін.

  9. Топчий И.И., Щербань Т.Д., Семеновых П.С.