Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с различными нарушениями сперматогенеза

страницы: 74–77

Веропотвелян Н.П., канд.мед.н, глав. врач Погуляй Ю.С. Журавлева С.А. Веропотвелян П.Н., канд.мед.н, заведующий отделением отделение патологии репродуктивной функции человека Кодунов Л.А. заведующий отделением > отделение пренатальной диагностики, ОКУ «Межобластной центр медицинской генетики и пренатальной диагностики», г. Кривой Рог

 

Возможные генетические причины мужского бесплодия

Роль Y-хромосомы в процессе сперматогенеза

Диагностика микроделеций AZF-локуса

Клиническая картина при микроделециях Y-хромосомы

Материалы и методы исследования

Результаты

Обсуждение

Заключение

 

Обзор статистических данных по изучению репродуктивной функции в человеческой популяции по всему миру показал, что 2-7% супружеских пар являются бесплодными [1, 2]; согласно данным Emmet J. Lamb (1994), среди американских пар – от 10 до 20% [3].

По оценкам ВОЗ, эта цифра достигает 15% (60-80 млн пар). При этом первичное бесплодие наблюдается у 30% супругов [4].

Исследования 3956 бесплодных пар в семи лабораториях мира показали, что мужское бесплодие наблюдается в 40% случаев [1]. Согласно отчету по проведенным исследованиям в 33 центрах 25 стран мира, 10,7% мужчин в бесплодных браках имеют азооспермию или олигозооспермию [2, 5].

Результаты первичного медицинского обследования и спермиологического анализа позволяют дать предварительную оценку причины нарушения репродуктивной функции у мужчины. Обычно мужское бесплодие классифицируют на основе результатов спермограммы.

В 2010 г. ВОЗ переиздала стандартный протокол для исследования бесплодных пар. Согласно этим рекомендациям, нормальные показатели спермограммы должны быть следующими: количество сперматозоидов 15 × 106/мл, из которых больше 40% подвижны, больше 58% живые, около 4% с нормальной морфологией, при этом не должно содержаться более чем 1 × 106/мл лейкоцитов [6].

Нарушения сперматогенеза могут быть обусловлены разными причинами: воспалительными заболеваниями половых органов, недоеданием, эндокринологическими расстройствами, влиянием неблагоприятных факторов окружающей среды, аллергизацией, широким и бесконтрольным применением лекарственных препаратов, злоупотреблением алкоголем, курением, а также генетическими дефектами [7, 8].

Генетические дефекты (мутации и хромосомные аномалии) наблюдаются в 30% случаев мужского бесплодия [2, 9].

Возможные генетические причины мужского бесплодия В начало статьи

При изменении нормальной функции генетического аппарата, связанного с мутациями мужского генома, нарушения могут возникать на разных уровнях: при формировании половых органов, сперматогенезе, созревании сперматозоидов в придатках, их транспорте в репродуктивном тракте и эякуляции, проникновении через цервикальную слизь, капацитации, акросомальной реакции, оплодотворении яйцеклетки и т.д. [10].

Хромосомные аномалии, которые обусловливают бесплодие, делятся на два типа: изменение кариотипа в соматических и половых клетках и мейотические нарушения.

Частота нарушения кариотипа у бесплодных мужчин составляет около 7% (De Breakelur and Dao,1991). Хромосомные аномалии чаще выявляют у пациентов с азооспермией – в 13,7% случаев (большую часть составляет синдром Клайнфельтера) (Foresta et al., 2002; Калантари П. и др., 2003). Аномалии половых хромосом преобладают у мужчин с азооспермией, аномалии аутосом – у пациентов с олигозооспермией (Foresta et al., 2002) [4].

Мейотические нарушения наблюдаются у 6% мужчин (Egozcue et al., 1983; De Breakelur and Dao,1991), и эта частота повышается до 17,5% у лиц с олигозооспермией (≤ 1 × 106/мл) (Vendrell et al., 1999).

На сегодняшний день уже известно множество генов (A-MYB, AZH, BCLW, HPY, LVS и др.), расположенных на разных хромосомах, которые отвечают за процесс сперматогенеза. И нарушение этого процесса обусловлено большим количеством мутаций в генах-координаторах [2].

Однако намного раньше была открыта главенствующая роль Y-хромосомы в процессе сперматогенеза.

Роль Y-хромосомы в процессе сперматогенеза В начало статьи

Долгое время Y-хромосома считалась функционально инертной, и контроль за детерминацией пола (ген SRY) считался единственно важной функцией данной части генома (Hamilton, 1967). Тем не менее эта теория была опровергнута, когда произошло открытие участка Y-хромосомы, отвечающего за сперматогенез.

Впервые роль делеций локуса Yq11 в этиологии нарушения сперматогенеза и бесплодия у мужчин была показана в 1976 г. Tiepolo и Zuffardi [11].

У шести мужчин с азооспермией была обнаружена делеция всего гетерохроматина дистального участка длинного плеча Y-хромосомы (Yq), и азооспермия при этом была единственным симптомом [2].

Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили с помощью STS-технологии (sequence-tagged sites) построить детальную картину Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала [12].

Было подтверждено наличие в дистальной части длинного плеча Y-хромосомы локуса azoospermia factor (AZF), делеции которого ответственны за нарушение сперматогенеза (рис.1).

ris1.jpg
Рис. 1. Карта Y-хромосомы с указанием ее локусов и некоторых генов [7]

В 1996 г. Vogt et al. на основе полученных данных о локализации и размере делеций, выявленных у 26 мужчин, предложили выделить в локусе Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и AZFc [7]. Позже был открыт четвертый регион (AZFd), который был отнесен к AZFc-региону [13].

Впоследствии для каждого субрегиона были выделены кандидатные гены, ответственные за нарушение сперматогенеза: для AZFa – USP9Y (DFFRY) и DBY (dead box on the Y), для AZFb – RBMY, AZFc-региона – DAZ (deleted in azoospermia) [11].

Функции вышеперечисленных генных семейств пока досконально не изучены, однако уже известно, что все они кодируют РНК-связывающие белки.

Диагностика микроделеций AZF-локуса В начало статьи

Еще несколько лет назад анализ AZF-региона выполнялся в экспериментальных целях. После расшифровки строения AZF-локуса и применения ПЦР-технологии анализ микроделеций Y-хромосомы стал популярным и широко распространенным.

Для стандартизации данного вида исследований в 1999 г. было создано руководство Laboratory guidelines for the molecular diagnosis of Y-chromosomal microdelesion (EMQN).

Согласно данному руководству, набор ПЦР-праймеров для диагностики микроделеций Y-хромосомы должен охватывать следующие STS-сайты: SY14 (SRY), ZFX/ZFY, SY84, SY86, SY127, SY134, SY254, SY255.

При таком подходе в разных исследованиях частота микроделеций AZF-локуса варьировала от 1 до 35%, что объясняется различными критериями отбора пациентов [12].

Клиническая картина при микроделециях Y-хромосомы В начало статьи

Делеции AZF-локуса связаны с различной степенью нарушения сперматогенеза – от умеренного снижения его активности (гипосперматогенез) или блока сперматогенеза до практически полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах – синдром клеток Сертоли (СКС) [11, 20].

Делеции в локусе AZF могут быть полными, т.е. целиком удаляющими один AZF-регион или более, и частичными, если делеции не полностью захватывают какой-либо из трех его регионов. Практически во всех случаях полные делеции являются мутациями de novo и приводят к азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени [14].

Строгой зависимости степени и стадии нарушения сперматогенеза от локализации и размера делеций локуса AZF обнаружено не было, однако ряд общих генофенотипических корреляций удалось выявить [11, 13].

Делеции AZFa и AZFb-регионов обусловливают азооспермию в 2/3 случаев и более редко фенотипически проявляются в виде олигозооспермии. При гистологическом исследовании тканей яичек AZFa-делеция всегда проявляется как СКС. Основываясь на этом, ученые полагают, что гены AZFa-региона регулируют первые фазы сперматогенеза или активность стволовых клеток.

Вариабельные нарушения сперматогенеза при делециях AZFb-региона свидетельствуют о множественной функциональной активности RBMY-гена или его комбинаторной активности с другими генами.

Следовательно, пациентам с делециями AZFa и AZFb-субрегионов, которые ассоциированы с невозможностью получения зрелых половых клеток (при проведении диагностической биопсии получить сперматозоиды невозможно), необходимо рекомендовать иные пути решения репродуктивных проблем – донорские программы или усыновление [15].

Анализ литературы показал, что делеции AZFc могут ассоциироваться с азооспермией (54%) и тяжелой олигозооспермией (46%); гистологическая оценка тканей яичка варьирует от СКС до гипосперматогенеза. При этом канальцы с различными дефектами могут быть найдены у одного и того же индивидуума. Также считается возможным, что тестикулярные повреждения, обусловленные делецией AZFc, могут прогрессировать, и у пациентов с олигозооспермией с возрастом может развиться азооспермия. Однако у мужчин с AZFc-делециями примерно в 71% случаев удается получить зрелые сперматозоиды, пригодные для искусственного оплодотворения [14].

Вариабельный фенотип, который наблюдается при делеции AZFb и AZFc-регионов, может быть объяснен посредством следующих гипотез.

  1. Различная величина делеций.

Делеции могут затрагивать целый AZFb- или AZFc-регион либо они могут быть минимальными, захватывающими только один ген, генный кластер или несколько STS-маркеров. При этом предполагается, что тяжесть фенотипических проявлений напрямую зависит от величины делеции. Однако отдельные случаи опровергают данную гипотезу [13].

  1. 2. Роль гомологичных генов и генетического фона.

Каждый AZF-ген имеет гомолога на Х-хромосоме (DBX, USP9X, RBMX) или на аутосомах (DAZL1). Участие гомологов в процессе сперматогенеза не наблюдается, однако можно предположить, что их экспрессия меняется при делециях на Y-хромосоме. Генетический фон (другие гены семейства) также может модифицировать фенотипический эффект имеющихся делеций [13].

В настоящее время для мужчин с тяжелой формой олигозооспермии единственно эффективным методом преодоления бесплодия является метод Intracytoplasmic Sperm Injection (ICSI) – введение сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки, а для пациентов с азооспермией – ICSI в сочетании с извлечением тестикулярных сперматозоидов с помощью TESA или TESE (производят биопсию яичка и из полученной ткани выделяют сперматозоиды, которыми позже оплодотворяют яйцеклетку) [16].

В ряде случаев использование современных вспомогательных репродуктивных технологий позволяет иметь собственных детей мужчинам, несущим делеции Y-хромосомы. Однако следует отметить наличие у них риска передачи данной делеции Y-хромосомы (в 100% случаев), а также повышенного риска рождения детей с мозаицизмом 45,Х0/46,ХY [11, 17].

Материалы и методы исследования В начало статьи

Для исследования было отобрано 218 мужчин в возрасте от 26 до 45 лет, проживающих в областях Центрального и Юго-Восточного регионов Украины, которые обратились в наш центр в связи с нарушением фертильности. В выборку вошли только мужчины с нормальным кариотипом.

Все пациенты были разделены на три группы. Первую группу составили 70 мужчин с азооспермией; во вторую группу отобраны 72 пациента с олигозооспермией различной степени тяжести; в третью – 76 лиц с другими формами патозооспермии.

Исследования на наличие микроделеций AZF-локуса Y-хромосомы проводили методом ПЦР с детекцией путем электрофореза в 2% агарозном геле (наборы GenPak AZF PCR test ООО «Лаборатория Изоген», Москва).

Для диагностики использовались образцы ДНК, выделенные из крови. Кровь получали методом венепункции в одноразовые пластиковые пробирки с консервантом (раствор ЭДТА).

analiz-Mikrodeletziy_ris_2_big.jpg
Рис. 2. Обнаружение микроделеций Y- хромосомы в локусе YqAZF. Мультиплексная ПЦР

ДНК была выделена с использованием наборов для выделения ДНК Diatom DNA Prep 200 и Magna DNA Prep 200 (ООО «Лаборатория Изоген», Москва).

ПЦР проводили на программируемом термоциклере Gene Amp PCR System 2700 производства фирмы Applied Biosystems (США).

Для анализа использовались следующие STS-маркеры: sY238, sY84, sY127, sY14, sY86, sY255, sY254, sY134 (рис. 2).

Результаты В начало статьи

Среди 218 обследованных микроделеции локуса AZF были обнаружены у 25 (11,5%) пациентов. В группе мужчин с азооспермией делеции были отмечены у 18 (25,7%) лиц, в группе с олигозооспермией тяжелой степени – у четырех (5,5%). В группе пациентов с другими формами патозооспермии делеции выявлены у троих пациентов (3,9%), причем во всех случаях фенотипическим проявлением была астенозооспермия. Наиболее высокий показатель наблюдался для делеций AZFb+c (42%); 31% составили делеции AZFb-региона; 15% – AZFс-региона; 12% – AZFа-региона.

У всех пациентов с делециями AZFа и AZFb-регионов отмечалась азооспермия. У мужчин с делецией AZFс выявлена азооспермия и олигозооспермия (3 и 1 случай соответственно).

При делециях AZFb+с наблюдались все типы нарушения сперматогенеза (азооспермия 45,5%; олигозооспермия 27,3%; астенозооспермия 27,2%).

Обсуждение В начало статьи

Большинство работ сфокусировано на обследовании мужчин с азооспермией и олигозооспермией (средняя частота составляет 10,5%). Так, полученные в ходе нашего исследования данные вписываются в рамки общемировой статистики.

Распространенность делеций растет при более строгом отборе пациентов: в группе мужчин с олигозооспермией (безвыборочно) – 2,9 и 11,6% при таком отборочном критерии, как идиопатическая олигозооспермия; среди мужчин с азооспермией (безвыборочно) – 7,3%, а при обструктивной азооспермии – 10,5 и до 18% в случае только идиопатических форм [13]. При этом частота делеций AZFa, AZFb и AZFc различна.

По данным анализа, проведенного Forresta et al., делеции AZFc-региона наблюдаются в 59,6% случаев; AZFb – в 15,8% и только 4,9% случаев составляют делеции AZFa-региона.

Большие делеции, включающие два или три региона, обнаруживаются у 13,6% пациентов, хотя при этом 6% делеций выявляются в регионах, не перекрывающих AZF-интервалы.

Распределение по классам микроделеций в случае нашего исследования оказалось несколько иным. Чаще всего встречались делеции AZFb+c и AZFb (в сумме – 73% всех выявленных микроделеций) с различными фенотипическими проявлениями. Превышение частоты делеций AZFb+c также отмечено и в Западном регионе Украины (Макух Г.В., 2012) [21].

Это может объясняться как специфичностью группы выборки, так и, возможно, является популяционной характеристикой Центрального и Юго-Восточного (Днепропетровская, Кировоградская, Черкасская, Херсонская и Николаевская области), а также Западного регионов Украины, что требует дальнейшего изучения.

Заключение В начало статьи

Как показывают многочисленные исследования, одним из наиболее сложных вопросов в области исследований AZF-микроделеций остается выяснение генофенотипических корреляций.

Основной проблемой является клиническое ведение пациентов с делециями локуса AZF. При этом необходимо учитывать не только факт наличия делеции с ее определенным фенотипическим проявлением, но и возможное прогрессирование в сторону ухудшения показателей спермограммы, а также уровень гормонов (в частности уровень фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови при делециях может быть снижен, а ингибина В – повышен) [11, 18].

Также имеются данные, что патоспермия может быть причиной невынашивания беременности [22], что, по-видимому, требует расширения спектра показаний для обследования мужчин на наличие микроделеций Y-хромосомы.

Необходимо учитывать, что большинство микроделеций AZF-локуса представляют собой мутации de novo, однако известно о случаях передачи Y-микроделеций от отца к сыну [11]. В ряде случаев размер делеции у сына с бесплодием был больше, чем у отца [19].

Результаты исследований Y-хромосомы человека свидетельствуют о том, что ее палиндромная область, располагающаяся в локусе AZF, является наиболее сложноустроенным участком во всем геноме человека в отношении протяженных блоков повторяющихся участков (ампликонов), значительно варьирует по составу и композиции повторов и имеет одну из самых высоких частот мутаций [14].

На сегодняшний день диагностика микроделеций Y-хромосомы не только позволяет выяснить причину определенных нарушений репродуктивной функции мужчины, но и избежать неэффективного и дорогостоящего лечения, а также является решающим фактором при применении репродуктивных технологий.

Популяризация молекулярно-генетических исследований в данной области способствует широкому охвату пациентов и позволяет делать такую диагностику скрининговой для мужчин с нарушением сперматогенеза. Поэтому всем пациентам с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени, а также тем, которым планируется программа экстракорпорального оплодотворения, в рамках комплексного клинико-генетического обследования необходимо обязательное проведение анализамикроделеций Y-хромосомы и последующего медико-генетического консультирования [11].

 

Литература

1. Spira A. Epidemiology of human reproduction// Hum. Reprod.- 1986.- P.111-115.

2. Kun Ma, Con Mallidis. The role of Y chromosome deletion in male in fertility//Eu.jornal of endocrinology. – 2000.

3. Human reproductive ecology. Interactions of Environment, Fertility, and Behavior// Annals of The New York Academy of Science

4. Денисенко С.В., Дарий А.С. Генетика репродукции: Киев. - 2008.

5. Camhaire FH, de Kretser D. Towards more objectivity in diagnosis and management of male infertility// Diagnosis and treatment of infertility. – 1982 . – P/1-33.

6. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Third edition//World Health Organization .-1992. – P.44.

7. Skakkeback NE. Patogenesis and management of male infertility//Lancet.- 1994. – P.1473-1479.

8. О. Д. Никитин. Мужской фактор бесплодного брака: состояние проблемы// Здоровье женщины.- №10.-2009.-с.173-177.

9. Bhasin S.Ma & de Kretse DM. Y-chromosome microdeletions and male infertility// Annals of Medicine .- 1997.-P.261-269.

10. Э.В. Вартанян, А.Н. Петрин, Т.Р.Курносова. Генетические факторы мужского бесплодия// Проблемы репродукции . – 2012. -№2.

11. Черных В.Б. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований// Мед. ген. – 2003. -№8. – Т.2. –С.367-379.

12. Vollrath D.The Human Y chromosome:a 43-interval map based on naturally occurring deletions// Science. – 1992. - P.52-59.

13. Foresta C. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis// University of Padova. Italy.

14. В.Б.Черных. AZF делеции – частая генетическая причина бесплодия у мужчин: современное состояние исследований. // Проблемы репродукции.-№1.-2009.-с.10-15.

15. В.Б.Черных, Л.Ф.Курило, В.А.Поляков. Y- хромосома, AZF-микро- делеции и идиопатическое бесплодие у мужчин (обзор литературы)// Проблемы репродукции.-№5.-2001.

16. Гоголевский П.А. с соавт. AZF- микроделеции и мужское бесплодие// Андрология и генитальная хиургия. -2001. -№4. –С. 73-77.

17. Kent-First M.G. et al. The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions and their infertile fathers//Mol.Hum.Reprod. – 1996. –P.943-949.

18. Foresta C.,Ferling A. Deletion and expression analysis of AZFa genes on the human Y chromosome revealed a major role for DBY in male infertility// Hum.Mol.Genet. – 2000. – P.1161-1169.

19. Van Golde R.J. Decreased fertilization rate and embryo quality after ICSI in oligozoospermic men with microdeletios in the azoospermia factor region of the Y chromosome// Hum.Reprod. – 2001. -№2 .-P.289-292.

20. Гоголевский П.А., Гоголевская И.К. Y- хромосома и мужское бесплодие (обзор литературы)// Проблемы репродукции. – 1999. -№5 . –Т5. –С.26-34.

 

В начало статьи

 

Поделиться с друзьями: